ブックタイトル戸田新細菌学　改訂34版

概要

戸田新細菌学　改訂34版

?細菌学的検査法971?後の紫外線を照射）で観察する．　抗酸菌は暗い背景に黄色から黄橙色に染まって観察される．400 倍拡大でも観察できるため，臨床材料の検鏡では迅速に全視野を観察できる（図??2?11）．　◆　 オーラミン染色液［S?22］：0.1 g のオーラミンO を95％エタノール10 mL に溶解する．これに3 g の石炭酸結晶を87 mL の蒸留水に溶かした溶液を加える．室温で褐色瓶に保存する．　◆　 0.5％塩酸アルコール［S?23］：100 mL の70％エタノールに0.5 mLの濃塩酸を加える．　◆　 過マンガン酸カリウム溶液［S?24］：0.5 g の過マンガン酸カリウムを100 mL の蒸留水に溶解する．褐色瓶に保存する．過マンガン酸の廃液処理が困難な施設では，レフレルのアルカリ性メチレン青液［S?14］を代用する．　 　オーラミン染色液にさらにローダミンB を添加したオーラミン・ローダミン染色液［S?25］も同じ染色手順で用いられる．　◆　 オーラミン・ローダミン染色液［S?25］：1.5g のオーラミンO と0.75 g のローダミンBをグリセロール75 mL に溶解する．10 mLの石炭酸と50 mL の蒸留水を混和した溶液を加え，24 時間撹拌して混和する．ガラスウールで濾過し，褐色瓶に入れて4℃で保存する．2．アクリジンオレンジ核酸染色acridine orange nuclear stain　臨床材料や培養液に含まれる細菌および真菌を検出する目的で，これらの微生物の核酸に結合する蛍光色素，アクリジンオレンジで染色して観察する．紫外線下で細菌および真菌のDNAはオレンジ色に，ヒト細胞に由来するDNA は緑色に観察される．　①　 塗抹標本を作製し，メタノール固定する．　②　 アクリジンオレンジ染色液［S?26］を満載して2 分間染色する．　③　 水洗，乾燥，検鏡する．　◆　 アクリジンオレンジ染色液［S?26］：アクリジンオレンジ保存液［S?27］0.5 mL を0.2 M酢酸緩衝液（pH4.0）5 mL に加える．　◆　 アクリジンオレンジ保存液［S?27］：アクリジンオレンジ1 g を蒸留水100 mL に溶解する．3．蛍光抗体法fluorescent antibody method　抗原・抗体反応を利用したプローブ検査の一つで，検査目的とする細菌に特異的な抗体を準備し，これにFITC（fluorescein isothiocyanate）やローダミンなどの蛍光色素を標識する．スライドグラスに塗抹した検体と反応させ，結合しなかった抗体を洗浄して取り除き，蛍光顕微鏡で観察すると，目的とする細菌が蛍光色調に輝いて観察できる（図??2?12）．標的抗原に直接結合する一次抗体ではなく，一次抗体を作製した動物種の免疫グロブリン（主にIgG）に対する特異抗体を蛍光標識して二次抗体として用いる間接法もある．検査対象とする抗原と用いる特異抗体が異なるだけで，基本的な検査手順は共通している．　①　 検査材料を無蛍光スライドグラスに円形に塗抹して乾燥させる．　②　 0.5 mL のアセトンを滴下して10 分間固定する．とくに冷アセトン（－20℃～8℃）を用いて固定する必要はない．室温で数分間アセトン処理すれば固定される．　③　 至適濃度に希釈したFITC 標識特異抗体を塗抹した標本に滴下して，湿潤箱に入れ，37℃で30 分間反応させる（反応温度は室温でも，35～37℃でもよい．反応時間は15～60 分間で十分であり，標本が乾燥しないかぎり延長してもとくに影響はない）．　④　 リン酸緩衝生理食塩液（PBS）を入れた容器に5 分間ずつ浸し，3 回洗浄する．この洗浄図??2?11．オーラミン染色での抗酸菌喀痰中のMycobacterium tuberculosis.図??2?12． 蛍光抗体法でのChlamydia trachomatisの観察